Principi della spettroscopia Raman

La spettroscopia è una tecnica analitica che utilizza la luce UV, visibile o infrarossa per misurare la composizione chimica. Consente di analizzare chimicamente i materiali in modo veloce, non invasivo e non distruttivo, senza marcatori. La misura della riflettanza del fascio focalizzato (FBRM - Focused Beam Reflectance Measurement), la spettroscopia ultravioletta/visibile (UV/Vis), la spettroscopia nel vicino infrarosso (NIR), la spettroscopia infrarossa (IR) e Raman sono esempi di metodi ampiamente utilizzati negli ambienti industriali di R&S o di processo.

All'interno di questa toolbox, le tecniche di spettroscopia vibrazionale—tra cui NIR, IR e Raman—sono tra gli strumenti più efficaci per conoscere la composizione e la struttura molecolare. La spettroscopia NIR utilizza la radiazione nel vicino infrarosso, la spettroscopia IR utilizza la radiazione infrarossa e la spettroscopia Raman utilizza la radiazione visibile o nel vicino infrarosso per misurare la composizione chimica e la struttura molecolare.

La spettroscopia vibrazionale è particolarmente preziosa perché fornisce informazioni chimiche specifiche senza richiedere un'impegnativa preparazione del campione. La spettroscopia Raman, un tipo dispettroscopia vibrazionale che fornisce un'impronta molecolare altamente specifica, è simile alla spettroscopia IR. Tuttavia, tra Raman e IR ci sono delle differenze che influiscono sui contesti in cui vengono utilizzate nelle applicazioni industriali.

Una differenza fondamentale tra la spettroscopia infrarossa e quella Raman è il modo in cui l'acqua impatta sullo spettro. L'acqua assorbe notevolmente la luce infrarossa, spesso oscurando i segnali IR provenienti da un campione, mentre non interferisce significativamente con il segnale Raman, rendendo la spettroscopia Raman più adatta alle misure in soluzioni acquose. Un'altra differenza risiede nelle lunghezze d'onda utilizzate: la spettroscopia Raman usa lunghezze d'onda visibili o nel vicino infrarosso, consentendo l'uso di fibre ottiche e rilevatori standard. La spettroscopia IR, invece, richiede fibre e rilevatori speciali perché usa le lunghezze d'onda dell'infrarosso. Ciò rende la spettroscopia Raman ideale per il monitoraggio remoto e per le installazioni in cui la distanza tra il rilevatore e la sonda è importante.

Quando interagisce con una molecola, la luce può essere rifratta, assorbita o diffusa. Nella diffusione, la maggior parte dei fotoni non interagisce con la molecola ma semplicemente "rimbalza" su di essa. Questo fenomeno è noto come diffusione di Rayleigh o diffusione elastica. Una piccola frazione di luce subisce una diffusione anelastica, in cui i fotoni interagiscono con le vibrazioni o le rotazioni molecolari, determinando spostamenti di energia. Questi spostamenti formano uno spettro Raman che rappresenta l'impronta molecolare. La maggior parte degli strumenti spettroscopici Raman misura queste vibrazioni molecolari.

Scattering Raman
Scoperto nel 1928 da C.V. Raman e K.S. Krishnan, lo Scattering Raman descrive come una piccola frazione della luce diffusa da una molecola cambia frequenza a causa del trasferimento di energia dovuto alle vibrazioni molecolari. I primi studi sul principio Raman sono stati effettuati utilizzando la luce solare come sorgente luminosa e apparecchiature fotografiche. Nel documento originale di Raman e Krishnan è stata registrata una "eccessiva debolezza dell’effetto". Non era raro che i ricercatori trascorressero ore o addirittura giorni a raccogliere un singolo spettro. L'avvento dei laser, dei rilevatori sensibili e degli elementi ottici olografici ha migliorato la velocità, la risoluzione e la sensibilità della spettroscopia Raman. Oggi, un singolo spettro Raman può essere misurato in pochi minuti o addirittura in secondi. 

Il processo di diffusione
Quando interagisce con una molecola, un fotone può eccitare un elettrone e portarlo in uno stato energetico virtuale. Se l'elettrone ritorna a un livello vibrazionale diverso, il fotone diffuso ha un'energia diversa, basata sull'energia iniziale della vibrazione molecolare

• Diffusione Stokes: il fotone perde energia (più comune)
• Diffusione anti-Stokes: Il fotone guadagna energia (meno intensa)

Queste differenze di energia vengono rappresentate graficamente come spostamenti Raman in numeri d'onda (cm⁻¹) in uno spettro. Dato che le molecole hanno molte vibrazioni, ognuna con energie diverse, questi spostamenti forniscono informazioni sui vari gruppi funzionali all'interno della molecola.

Energie vibrazionali
L'energia vibrazionale dipende da una serie di proprietà molecolari:

• Massa atomica
• Ordine di legame
• Geometria molecolare
• Legame a idrogeno

La spettroscopia Raman può misurare vari aspetti compositivi e strutturali di una molecola, compresi lo scheletro e le catene laterali, e ciò la rende preziosa in campi come la scienza dei materiali, i polimeri, gli oli commestibili e la biochimica.

Regole di selezione
Una vibrazione è attiva Raman se provoca un cambiamento nella polarizzabilità. In genere, le vibrazioni di allungamento o le vibrazioni simmetriche sono attive Raman. Questo meccanismo va a complemento della spettroscopia IR, dove una vibrazione deve modificare il momento di dipolo e in genere comporta vibrazioni asimmetriche.

• Forti diffusori Raman: molecole con nubi di elettroni delocalizzate (ad es. legami C=C)
• Diffusori deboli: legami altamente polari (ad es. O–H)

Per migliorare il segnale Raman o ridurre l'interferenza della fluorescenza, si continua a sviluppare varianti della spettroscopia Raman. Due importanti approcci di miglioramento sono la diffusione Raman risonante e la diffusione Raman potenziata dalla superficie.  

Diffusione Raman risonante (RR)
Quando il laser di eccitazione coincide con una transizione elettronica, alcune modalità vibrazionali vengono migliorate in modo risonante—di fattori che vanno da 10² a 10⁴. Questa tecnica è utile per studiare i cromofori e i composti aromatici.

Diffusione Raman potenziata dalla superficie (SERS)
La SERS migliora i segnali Raman di 10³–10⁶× quando le molecole vengono adsorbite su superfici metalliche nanostrutturate (ad es. argento, oro). Permette il rilevamento di concentrazioni micromolari, sebbene il suo utilizzo sia limitato dalla chimica di superficie e dalla cinetica di adsorbimento.

Storicamente, la spettroscopia Raman è stata utilizzata per l'analisi qualitativa ovvero per l'identificazione delle specie chimiche attraverso le loro impronte spettrali. Tuttavia, i progressi in materia di tecnologia olografica, analizzatori ad alto rendimento e analisi dei dati multivariati hanno reso possibile la spettroscopia Raman quantitativa.

• Raman qualitativo: identifica i composti
• Raman quantitativo: misura le concentrazioni in tempo reale

Fin dalla sua introduzione in ambiente industriale, a metà degli anni '90 del secolo scorso, la spettroscopia Raman basata sulla moderna strumentazione dispersiva è stata utilizzata per risolvere le sfide di identificazione, quantificazione e monitoraggio dei processi. Le prime applicazioni erano strettamente collegate a quelle già analizzate dalla spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) o FT-Raman, dato che la spettroscopia Raman fornisce informazioni simili sulla composizione e sulla struttura molecolare.

In molti di quei primi report, la spettroscopia Raman è stata testata solo dopo che i limiti di implementazione dei metodi FTIR o FT-Raman—come lo sporcamento della sonda di campionamento, l'elevata potenza del laser o l'incompatibilità con i sistemi acquosi—sono diventati evidenti. Dopo i successi iniziali, la fiducia dell'industria nella tecnica Raman e nella robustezza del suo hardware è cresciuta, portando a una più ampia adozione dei prodotti o dei processi basati su Raman.

Oggi, è dimostrato che la spettroscopia Raman fornisce la specificità del metodo FTIR con la facilità di misura della spettroscopia NIR. Attualmente, la spettroscopia Raman è vista come una tecnologia analitica di processo (PAT - Process Analytical Technology) di scelta prioritaria, piuttosto che come una PAT di ultima scelta.

Raman offre diversi e importanti vantaggi:

• Specificità: le bande ben definite e non sovrapposte consentono un'identificazione precisa
• Compatibilità con l'acqua: interferenza minima dalle bande dell'acqua
• Ampia gamma di concentrazione: da <1% a 100% senza diluizione
• Nessuna preparazione del campione: analisi senza contatto e non distruttive
• Velocità: spettri acquisiti in pochi secondi o minuti
• Versatilità: possibilità di usare contenitori standard (vetro, zaffiro, polimeri)
• Analisi quantitativa: l'intensità del segnale è proporzionale alla concentrazione molecolare

Dato che utilizza la luce visibile o nel vicino infrarosso, la spettroscopia Raman può essere associata a molti e diversi tipi di strumenti. Gli spettri Raman possono essere misurati utilizzando una strumentazione dispersiva accoppiata a un microscopio, un'unità portatile o sonde di misura in fibra ottica.

Un sistema Raman include:

• Sorgente di eccitazione laser
• Opzioni di trasferimento dell'eccitazione
• Interfaccia del campione (ad es. obiettivo del microscopio, ottica a immersione, sonda senza contatto, cella a flusso)
• Elementi ottici di raccolta
• Dispositivo di separazione delle lunghezze d'onda (ad es. spettrografo)
• Rilevatore ed elettronica
• Software di acquisizione e analisi dei dati

La spettroscopia Raman è uno strumento analitico versatile utilizzato su solidi, liquidi, gas e fluidi complessi—applicabile in un'ampia serie di settori e campi di ricerca.

Fasi della materia
La spettroscopia Raman può essere utilizzata su molti materiali, tra cui:

• Solidi: particelle, pellet, pellicole, fibre
• Liquidi: soluzioni, gel, paste
• Gas
• Fluidi in fase mista: sospensioni, fanghi, colture cellulari

Applicazioni industriali
La spettroscopia Raman svolge un ruolo fondamentale in numerosi settori industriali come, ad esempio, i seguenti:

• Industria farmaceutica: monitoraggio della reazione del principio attivo (API), trattamento delle dosi solide, identificazione dei polimorfi, ottimizzazione della formulazione, PAT
• Bioprocessi: monitoraggio e controllo delle colture cellulari a monte, strutture di ordine superiore, preparazione dei fluidi, concentrazione delle proteine target, formulazione dei prodotti, PAT
• Analisi forense industriale: identificazione dei materiali difettosi, identificazione dei polimorfi, aggregati, adulterazione
• Semiconduttori: analisi delle sollecitazioni e delle deformazioni, caratterizzazione dei materiali
• Polimeri e nanotecnologie: monitoraggio delle reazioni, analisi strutturale, controllo di qualità, cristallinità
• Prodotti chimici speciali: sintesi dell'ammoniaca, produzione di metanolo, monitoraggio delle reazioni di chimica fine, cristallizzazione, produzione di olefine
• Scienze ambientali e geologiche: cattura, utilizzo e stoccaggio del carbonio
• Industria alimentare: qualità dell'olio commestibile, cioccolato, carne coltivata, adulterazione, monitoraggio e controllo della fermentazione
• Oil & Gas: raffinazione, trattamento amminico, produzione di gas naturale

Espansione delle frontiere
Oggi, la risposta alla domanda se un problema di misura possa essere adatto alla spettroscopia Raman è generalmente "sì". L'affidabilità dell'hardware, le numerose modalità di misura del campione, la trasferibilità dei modelli e i bassi costi operativi rendono la spettroscopia Raman uno strumento di analisi interessante. Con la continua evoluzione della spettroscopia Raman, i nuovi progressi a livello di strumentazione e applicazioni stanno espandendo il suo impatto in contesti di ricerca, clinici e di laboratorio. Gli usi emergenti includono campi biomedicali come l'analisi dei tessuti e la diagnosi delle malattie ma anche la conservazione delle opere d' arte attraverso l'identificazione di pigmenti e materiali.

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